Ферменты микроорганизмов

Следует, впрочем, иметь в виду, что четкую грань между технической биохимией и биотехнологией провести достаточно трудно. Может возникнуть вопрос, почему в разделе, посвященном промышленным процессам инженерной энзимологии, речь идет в основном о получении пищевых продуктов. Дело в том, что иммобилизованные ферменты и клетки в основном используют в получении пищевых продуктов и в меньшей степени фармацевтических препаратов. Такое ограничение вызвано весьма малой доступностью (в широких масштабах) ферментов, способных катализировать реакции технологической значимости, например, в органической или неорганической химии, нефтехимии, полимерной химии, фармацевтической промышленности и т. д.

Напротив, традиционное использование растворимых ферментов в пищевой промышленности создало определенный фундамент для дальнейшего совершенствования методов в этой области.

Биотехнологические производства с использованием ферментов микроорганизмов К настоящему времени семь процессов с использованием иммобилизованных ферментов или клеток нашли крупномасштабное промышленное применение в ряде развитых стран мира: 1. Производство глюкозо-фруктозных сиропов и фруктозы из глюкозы. 2. Получение оптически активных L-аминокислот из их рацемических смесей. 3. Синтез L-аспарагиновой кислоты из фумаровой кислоты. 4. Синтез L -яблочной кислоты из фумаровой кислоты. 5. Производство диетического безлактозного молока. 6. Получение Сахаров из молочной сыворотки. 7. Получение 6-аминопенициллановой кислоты (пенициллинового ядра) из обычного пенициллина (пенициллина G) для последующего производства полусинтетических антибиотиков пенициллинового яда. 1. Получение глюкозо-фруктозных сиропов Фруктоза, или иначе фруктовый, плодовый или медовый сахар, широко распространена в природе.

Особенно богаты ей яблоки и помидоры, а также пчелиный мед, который почти наполовину состоит из фруктозы. По сравнению с обычным пищевым сахаром (в состав которого фруктоза также входит, но в виде химического соединения с менее сладкой глюкозой) фруктоза обладает более приятным вкусом, и согласно профессиональной терминологии вкус фруктозы «медовый», а обычного сахара — «приторный». Она на 60—70% слаще сахара и потреблять ее можно меньше, а значит, меньше будет и калорийность продукта. Это важно с точки зрения диетологии питания.

Фруктозу в отличие от глюкозы и пищевого сахара могут потреблять больные диабетом, так как замена сахара фруктозой существенно снижает вероятность возникновения диабета. Это объясняется тем, что усвоение фруктозы не связано с превращением инсулина. Кроме того, она в меньшей степени вызывает заболевание зубов , чем сахар.В смеси с глюкозой фруктоза не кристаллизуется (не засахаривается), поэтому нашла широкое применение в производстве мороженого, кондитерских изделий и т. д.

Несмотря на неоспоримые преимущества фруктозы по сравнению с обычным сахаром, вплоть до начала 70-х годов она не производилась промышленным путем. В 1973 г . американской компанией «Клинтон Корн» был внедрен в промышленность процесс превращения глюкозы во фруктозу под действием иммобилизованного фермента глюкозоизомеразы , этот процесс стал самым крупным в мире по сравнению с другими, в которых используются иммобилизованные ферменты.

Основы процесса.

Фермент глюкозоизомераза катализирует превращение глюкозы, получаемой при гидролизе крахмала (кукурузного или реже картофельного), в смесь глюкозы и фруктозы.

Образующийся глюкозо-фруктозный сироп содержит 42—43% фруктозы, около 51% глюкозы и не более 6% ди - или олигосахаридов, по сладости соответствует обычному сахару или инвертному сахару, получаемому кислотным (или ферментативным) гидролизом сахарозы. Для некоторых пищевых производств (например, безалкогольных напитков типа кока-колы) употребляют глюкозо-фруктозные сиропы с содержанием фруктозы 55 и 90%. Их в свою очередь изготавливают из обычных (42%-ных по фруктозе) сиропов с использованием разделительных процессов типа жидкостной хроматографии.

Глюкозо-фруктозная смесь поступает на рынок в виде сиропов.

Применяется при производстве тонизирующих и ацидофильных напитков, мороженого, кондитерских изделий, хлеба, консервированных фруктов и т. д.

Технологические варианты процессов. В литературе содержится немного данных о технологических деталях процессов.

Несмотря на то, что почти в каждом процессе применяются ферменты или клетки различного происхождения, имеющие неодинаковую каталитическую активность и полученные различными методами иммобилизации, все процессы имеют общие черты. 2. Получение L-аминокислот Аминокислоты — главный строительный материал организма, из которого формируются пептиды и белки.

Растения и микроорганизмы способны сами синтезировать все нужные им аминокислоты из более простых химических соединений.

Однако человеческий организм способен синтезировать лишь 12 из 20 аминокислот, необходимых ему для жизнедеятельности.

Остальные 8 аминокислот получили название незаменимых и должны поступать в организм извне — с пищей. При нехватке хотя бы одной из незаменимых аминокислот замедляется рост организма, проявляется патология.

Поэтому важно синтезировать эти аминокислоты в промышленных масштабах для корректировки рационов питания, в лечебных и профилактических целях и т. д. Кроме того, аминокислоты (как заменимые, так и незаменимые) являются важнейшим сырьем для обеспечения многих биотехнологических процессов.

Производство многих аминокислот, в том числе и незаменимых, —крупнотоннажная отрасль химической промышленности.

Однако с помощью химических методов получается смесь оптических изомеров аминокислот, иначе говоря, смесь Lи D - аминокислот, молекулы которых в Lи D -форме представляют собой зеркальные изомеры. В химических реакциях эти изомеры практически неразличимы, однако человеческий организм усваивает лишь L-аминокислоты (за исключением метионина). Для большинства биотехнологических процессов Dаминокислоты также не представляют ценности.

Разделение смеси Lи D - аминокислот, так называемой рацемической смеси, на составляющие их изомеры стало первым процессом в мире, осуществленным с помощью иммобилизованных ферментов на промышленном уровне. Этот процесс был реализован в Японии на предприятии, принадлежащем компании « Танабе Сейяку » в 1969 г . В течение 15 предшествующих лет данный процесс проводился с применением растворимого фермента аминоацилазы , но он был недостаточно экономичен. После перехода на иммобилизованную аминоацилазу экономическая эффективность процесса возросла в полтора раза, и в настоящее время компания осуществляет на промышленном уровне производство пяти L-аминокислот, из них четыре незаменимые (метионин, валин , фенилаланин , триптофан). В качестве исходного вещества используются ацилированные D, L-аминокислоты, полученные с помощью обычного химического синтеза.

Фермент аминоацилаза гидролизует один ацил-L-изомер , отщепляя от него объемную ацильную группу, и тем самым резко увеличивая растворимость образующейся L-аминокислоты по сравнению с присутствующим в реакционной системе ацил-Д-изомером . После этого вещества легко отделяются друг от друга путем известных физико-химических методов. Так выделяется чистая L-аминокислота.

Остающаяся ацил-О-аминокислота при нагревании рацеми-зуется , т. е. переходит опять в смесь ацилированных D, L-аминокислот, и процесс повторяют сначала. Таким образом, в итоге единственным продуктом является L-аминокислота.

Оказалось, что для аминоацилазы не имеет значения, какую аминокислоту ей гидролизовать , важно лишь строение ацильной части, к которой фермент имеет строгую специфичность. В результате этого одна и та же реакционная колонна с иммобилизованной амино-ацилазой может быть применена в производстве самых различных L-аминокислот.

Иммобилизованный фермент легко готовить, так как он легко адсорбируется на специальной смоле, которую затем помещают в реакционную колонну. Время полуинактивации иммобилизованного фермента в промышленных условиях составляет 65 сут . Когда активность катализатора падает ниже нормы, в колонну добавляют раствор свежего фермента (раз в несколько месяцев), который опять адсорбируется на носителе.

Устойчивость полимерного носителя высокая; так, на предприятии японской компании « Танабе Сейяку » он используется более 8 лет в одной и той же колонне без замены (I. Chibata , 1978). 3. Получение L-аспарагиновой кислоты Аспарагиновая кислота не принадлежит к числу незаменимых, но производится в мире многими тысячами тонн. Она находит широкое применение в пищевой промышленности для придания (в сочетании с другой аминокислотой — глицином) кондитерским изделиям и напиткам различных оттенков кислого или сладкого вкуса.

Аспарагиновую кислоту можно получать с помощью фермента аспартазы . В качестве исходных веществ для ферментативного синтеза используются фумаровая кислота и аммиак — крупнотоннажные продукты органического и неорганического синтеза.

Протекающая реакция одностадийна — в присутствии фермента молекула аммиака присоединяется к фумаровой кислоте по месту двойной связи с образованием оптически активной L -аспарагиновой кислоты. В этом процессе впервые в технологической практике были применены иммобилизованные клетки микроорганизма, содержащие фермент в его естественной микробной оболочке. Этот процесс был разработан японской фирмой « Танабе Сейяку » в 1973 г . Плотный гель с иммобилизованными в нем микробными клетками, содержащими аспартазу , формуют в кубики размерами 2—3 мм, набивают ими колонну объемом 1 м 3 и пропускают через нее раствор фумарата аммония. На выходе из колонны L -аспарагиновую кислоту кристаллизуют, центрифугируют и промывают холодной водой.

Процесс практически полностью автоматизирован и осуществляется в непрерывном режиме.

Масштабы производства на фирме « Танабе Сейяку »—1700 кг чистой L -аспарагиновой кислоты в сутки на реактор объемом 1 м 3 . 4. Получение L - яблочной кислоты Яблочная кислота находит спрос в качестве заменителя лимонной кислоты в продуктах питания и фармацевтических препаратах.

Химическим путем (гидролизом ангидрида яблочной кислоты) производят только рацемическую смесь оптических изомеров яблочной кислоты, в то время как оптически активный L -изомер, получаемый микробиологическим способом, пока слишком дорог для промышленного производства. L -яблочную кислоту получают ферментативным путем, так же как и L -аспарагиновую кислоту, из фумаровой кислоты. Здесь в качестве катализатора используют иммобилизованные в гель клетки, содержащие фермент фумаразу . В присутствии этого фермента происходит присоединение воды по двойной связи молекулы фумаровой кислоты. В остальном реакция протекает так, как и в случае L -аспарагиновой кислоты. В обычных ( интактных ) клетках время полуинактивации фумаразы составляет 6 сут , в иммобилизованных в полиакриламидный гель — 55 сут , а в иммобилизованных в гель на основе каррагинана — полисахарида из морских водорослей—160 сут 5. Получение безлактозного молока Лактоза, или молочный сахар, содержится в достаточно больших количествах в молоке и молочной сыворотке. Этот сахар характеризуется малой сладостью и низкой растворимостью, в его присутствии происходит кристаллизация мороженого и других молочных изделий и продуктов, что является причиной неприятных вкусовых ощущений.

Молекулы лактозы распадаются на глюкозу и галактозу при гидролизе под действием лактазы , или - галактозидазы . Молоко после такой обработки приобретает новые диетические качества, поскольку определенная часть населения не может употреблять молоко из-за наличия в нем лактозы. Это свойство организма получило название лактазной недостаточности.

Первый промышленный процесс получения безлактозного молока с использованием иммобилизованной лактазы был осуществлен итальянской фирмой « Сентрале дель Латте » в Милане.

Получаемое диетическое молоко несколько слаще по сравнению с обычным, поскольку глюкоза более сладкая, чем лактоза, однако это не мешает его употреблению.

Стабильность иммобилизованного фермента достаточно высока, и после 50 сут работы он сохраняет 80% первоначальной активности. 6. Получение сахаров из молочной сыворотки Молочная сыворотка содержит в своем составе большое количество лактозы — около 5% в жидкой и 75% в высушенной сыворотке.

Ферментативный гидролиз лактозы в сыворотке открывает новые возможности получения сахаристых веществ из нетрадиционного сырья, вносит определенный вклад в решение кормовой проблемы и в проблему охраны окружающей среды, поскольку сыворотка большей частью не утилизуется . Первый промышленный процесс гидролиза лактозы в молочной сыворотке с помощью иммобилизованной лактазы был реализован в 1980 г . совместно английской, французской и американской компаниями одновременно в Англии и Франции. Перед введением в колонный реактор с иммобилизованным ферментом сыворотку пастеризуют, подвергают ультрафильтрации и пропускают через ионообменник, чем добиваются ее деминерализации.

Мощность установки составляет около 1000 л при степени конверсии лактозы 80%. Установка полностью автоматизирована.

Получаемые при этом сахара (глюкоза и галактоза) по сладости в полтора раза превышают сладость пищевого сахара в расчете на одинаковые экономические затраты. По данным итальянской компании «Снам Проджетти », продолжительность работы иммобилизованного фермента в реакторе с молочной сывороткой существенно зависит от качества сыворотки и время полуинактивации фермента изменяется от 60 (при обработке депротеинизованной и деминерализованной сыворотки) до 8 сут (для необработанной кислой сыворотки), о связи с этим в промышленных условиях ежедневно по полчаса производят очистку колонны (с иммобилизованной лактазой ) Разбавленной уксусной кислотой. Время работы подобной системы в лабораторных условиях составляет около двух лет 7. Получение 6-аминопенициллановой кислоты Проведение химического деацилирования бензилпенициллина , обычно являющегося исходным сырьем для получения 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК), представляет трудную задачу из-за наличия в его молекуле чрезвычайно лабильного - лактамного кольца.

Поэтому в промышленности до недавнего времени обрабатывали бензилпенициллин бактериальной массой Е. coli , содержащей фермент пенициллинамидазу , который специфически и без побочных реакций расщеплял именно ту амидную связь, которая необходима для образования 6-АПК. В результате применения иммобилизованных бактериальных клеток, содержащих пенициллинамидазу , а затем и самой иммобилизованной пенициллинамидазы , удалось значительно повысить продуктивность и экономичность промышленного процесса получения 6-АПК. В 1975 г . процесс получения 6-АПК с использованием иммобилизованной пенициллинамидазы был внедрен в нашей стране. В настоящее время значительная доля 6-АПК в Италии и вся 6-АПК, выпускаемая в РФ, производится с помощью иммобилизованных ферментов.

Итальянская компания использует иммобилизованную пенициллинамидазу , полученную включением фермента в волокна триацетата целлюлозы. При этом эмульсию, образованную при смешивании раствора фермента с раствором триацетата целлюлозы в метиленхлориде , подвергают экструзии в нити.

Волокна закрепляют вдоль термостатируемой колонны и пропускают через нее 6%-ный раствор бензилпенициллина до степени конверсии последнего 97% или выше. По данным итальянских ученых, общий выход 6-АПК составляет 85% с чистотой 96% и выше. По технологии компании « Танабе Сейяку », использующей бактериальные клетки, иммобилизованные в полиакриламидный гель (с временем полуинактивации 42 сут при 30°С или 17 сут при 40°С), общий выход 6-АПК составляет около 80%. На советском производстве употребляют пенициллинамидазу , иммобилизованную в полиакриламидном геле, модифицированном глутаровым альдегидом. ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ПРЕВРАЩЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ В САХАРА Целлюлоза построена из звеньев D-глюкозы, которые соединены 1-4- - глюкозидными связями (по типу «голова к хвосту») в длинные, вплоть до тысяч глюкозных единиц, цепи, уложенные в плотную упаковку со своеобразной кристаллической структурой.

Прочность упаковки обусловлена главным образом тем, что цепи поперечно «прошиты» водородными связями, которые по отдельности относительно слабы, но в совокупности с тысячами других образуют, можно сказать, монолитный блок. В результате целлюлоза не только нерастворима в воде, но ее кристаллические участки непроницаемы практически для любых химических агентов, в том числе и для сильных кислот. Но там, где плотная упаковка глюкозных цепей нарушена (на поверхности целлюлозы, в местах поворота цепей, а также после специальной обработки целлюлозы, например с помощью интенсивного измельчения), образуются «аморфные области», куда могут проникать и растворители, и механические агенты. Это свойство используется при промышленном получении так называемой микрокристаллической целлюлозы, которая широко применяется для специальных химических целей.

Природную целлюлозу обрабатывают кислотой, аморфные участки легко расщепляются и уходят в раствор, оставляя мелкие микрокристаллиты , чрезвычайно стойкие к химическим реагентам.

Целлюлолитические микроорганизмы и ферменты В природе имеются так называемые целлюлолитические микроорганизмы, содержащие набор ферментов — целлюлаз , способных к расщеплению не только аморфной, но и кристаллической целлюлозы до глюкозы.

Попадая на поверхность целлюлозосодержащего материала и прикрепляясь к ней, микроорганизм выделяет целлюлазы , под действием которых субстрат целлюлаза в непосредственной близости от грибка-паразита расщепляется до конечного продукта — глюкозы.

Микроорганизм поглощает глюкозу в качестве основного продукта питания, размножается, растет, захватывая все большие участки поверхности, выбрасывает все новые и новые порции ферментов, пока не истощится доступная целлюлоза.

Однако эти процессы протекают весьма медленно. Для того чтобы пень в лесу полностью сгнил, нужны годы. Если же отделить от микроорганизма ферменты целлюлазы , сконцентрировать их и добавить к целлюлозе, процесс значительно ускорится. При этом образующаяся глюкоза не потребляется грибками, а накапливается в реакционной смеси. Кроме того, если в качестве субстрата использовать не чистую целлюлозу, а целлюлозосодержащие отходы промышленности или сельского хозяйства, то можно решить и еще одну важную проблему — утилизацию отходов.

Полученная глюкоза в зависимости от ее чистоты и экономической эффективности процесса может найти применение в медицине, пищевой промышленности, тонкой химической технологии или технической микробиологии.

Глюкозу, как известно, можно сбраживать в этанол и затем употреблять как «жидкое топливо» в качестве заменителя части нефтепродуктов.

Наконец, дегидратация энатола дает этилен — основу современной «большой химии». Целлюлоза на нашей планете — самое «крупнотоннажное» из всех возобновляемых видов сырья.

Ежегодный естественный прирост целлюлозы составляет около 100 млрд. т.

Использование человеком части этого сырья приводит к накоплению значительного количества целлюлозосодержащих отходов. Если даже малую долю этих отходов превращать ферментативным путем в полезные продукты, это даст ощутимый (и возобновляемый!) источник пищевых углеводов и заменителей нефти.

Поэтому данной проблемой в последние годы столь упорно занимаются и исследователи, и технологи всего мира.

оценка стоимости для нотариуса в Калуге
экспертиза коттеджа в Орле
оценка стоимости предприятия бизнеса в Брянске